光声与纳米药物在体内的实时药物评价

时间:

2019-12-03

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纳米医学(Nanomedicine,NMs)致力于通过改造纳米材料开发新的治疗工具,将药物或诊断试剂靶向输送到病变部位,从而打破诊断和治疗医学发展的困境。近几十年来,无数的研究成果革新了治疗的方式,丰富了高精度诊断方法。未来,纳米药物甚至可以通过调整其表面化学性质、形状和大小以及识别群体来实现个性化的治疗和诊断,从而达到理想的治疗效果。纳米药物的药物评价对于纳米药物进一步产业化和临床应用具有重要意义。随着纳米技术的发展,精细纳米复合材料的优化和操作以及表面相互作用的研究越来越受到重视,利用纳米复合材料可以进一步提高体内治疗效果,降低副作用。


因此,了解结构-功能关系的内在联系仍然是纳米医学发展的第一要务,特别是对纳米药物体内行为的无创可视化。为了应对这些挑战,化学家和生物学家在开发原位监测体内纳米药物代谢行为的成像技术方面做出了巨大努力。目前的方法主要是将化学标记嵌入纳米药物中,包括荧光探针、光声试剂、同位素标记等。这些探针的一个共同的局限性是它们的空间分辨率相对较低,尤其是对于深部组织。因此,对体内纳米药物在深部组织中的代谢和分布进行监测仍然面临挑战。近年来,近红外二区(NIR-II,1000-1700nm)成像技术以其低背景噪声、高空间分辨率、高灵敏度等优点成为肿瘤和脑深部成像的一种新的工具,并在临床前药物开发中发挥着重要作用。近几年在近红外-Ⅱ技术方面取得的成就已经证明可以在高分辨率下实现20毫米的组织穿透。然而,具有高性能的NIR-II发光团仍然很少见,许多发光团在NIR-II处的信号很弱。基于供体-受体-供体(D-A-D)的主链结构,近红外-Ⅱ试剂已被广泛构建。用于构建NIR-II发射分子的受体核通常仅限于苯并双噻唑(BBT)单元。


因此,寻找可供选择的NIR-II核心单元以扩展为具有明显NIR-II信号的NIR-II材料库是一个根本性的挑战。在本研究中,研究者试图探索噻二唑苯并三唑(BTZ)作为一种可替代的近红外-Ⅱ型荧光团(DTTB),它在808nm处具有13.4%的高荧光量子产率和4.9×104L mol-1cm-1的大吸收系数。此外,获得的NIR-II荧光团DTTB被结合到聚乙二醇胶束中,以非侵入性地方式显示纳米药物在体内的代谢行为(图1)。利用全身成像技术,研究了纳米胶束的PEG长度对其在血液中循环时间的影响。通过NIR-II荧光和光声双模成像可以清楚地显示肿瘤的靶向性。此外,优化后的纳米药物经近红外辐照后,实现了高效的肿瘤清除。这项工作提供了一种替代性的高荧光近红外-Ⅱ荧光团,可用于体内纳米药物的实时药物评价。


广州医科大学郭伟圣教授课题组——光声与纳米药物在体内的实时药物评价

图1. 利用近红外-Ⅱ荧光和光声双模型成像实时评价聚乙二醇化纳米药物的药物行为示意图


该研究合成一种可替代的D-A-D共轭低聚物(DTTB),其NIR-II发射峰在~1000nm处,荧光量子产率高达13.4%,吸收系数高达4.9×104 L mol-1 cm-1。通过将DTTB分子结合在DSPE-PEG上得到三种DTTB@PEG,制备出具有不同链长PEG修饰的NMs,并表现出了固有的荧光和光声成像能力。采用NIR-II荧光和光声成像技术,以实时、无创的方式,对NMs的聚乙二醇化相关药物行为进行了综合评价。


实验方法



体内光声成像


小鼠麻醉,氧气流量为2 L/min,混合3%异氟醚,并在37℃的加温动物床上保持麻醉状态。图像是通过Vevo LAZR系统(FUJIFILM VisualSonics, Toronto, Canada)获得的。带有4T1肿瘤(皮下)的BALB/c裸鼠静脉注射聚乙二醇化NM(DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K,和DTTB@PEG-5K;100μL,1.0 mg/mL),当肿瘤体积约为100 mm3时。在680、730、790和910nm的激光照射下,在注射后不同时间采集光声图像。


实验结果


纳米药物(NMs)的结构特性(表面、形状、成分和尺寸)对其在体内的药物特性有很大的影响。尤其是用聚乙二醇(PEG)修饰NMs的表面,即PEG化后,可通过避免NMs的聚集和吞噬来延长NMs的系统循环时间,从而提高NMs输送到目标组织的概率。尽管聚乙二醇化对NMs系统药代动力学的影响已经被研究了几十年,但对这一问题的深入研究却很少以实时可见的方式进行。与传统的药物评价方法相比,生物医学成像技术(MRI、PET、photo imaging等)具有无创性的特点,无需牺牲大量动物即可实现体内药效学行为的实时监测和定量。将活体成像技术应用于药物评价,可以大大提高制药行业从实验室概念到商业产品的效率。因此,在DTTB体外良好的近红外荧光特性的基础上,研究者通过NIR-II荧光和光声双模成像来评价NMs与各种PEG配体在体内的药物分布。制备了一个小的纳米药物库,这些纳米药物与各种PEG配体结合,包括DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K,和DTTB@PEG-5K。以聚乙二醇化NMs为研究对象,研究了PEG链长度对4T1荷瘤小鼠体内给药效率和药代动力学的影响。NIR-II荧光成像和光声成像如图2所示。注射后6-24小时,肿瘤区域的近红外-Ⅱ荧光强度和光声强度均显著增加,由于增强的通透性和EPR效应,聚乙二醇化NMs在肿瘤区域逐渐积聚。聚乙二醇化NMs在肿瘤区域的富集也通过光声和荧光信号强度在体内进行半定量(图2B和D)。值得注意的是DTTB@PEG-3K在肿瘤部位的信号增强最为明显。于注射后36h采集小鼠主要脏器和肿瘤组织,用NIR-II荧光成像法进行组织分布定量。虽然在肝脏和脾脏中观察到最强的荧光,但与其他器官相比,肿瘤呈现出非常明显的荧光信号。图2E中的量化报告显示DTTB@PEG-3K(10.16±2.95%ID/g)相比于DTTB@PEG-1K(3.44±1.21% D/g)和DTTB@PEG-5K(5.41±1.55% ID/g)摄取效率最高。这意味着NMs的肿瘤部位积聚与PEG链长度有关。对NMs在血管中的循环行为进行详细的无创体内研究,结果表明了DTTB@PEG-3K具有更长的循环寿命。此外,药代动力学研究证实了DTTB@PEG-3K(1.49小时)相比于TB@PEG-1K(0.54小时)和DTTB@PEG-5K(0.95小时)在体内停留的时间更长。纳米颗粒表面能呈现出不同的PEG分子构象状态,这与PEG链长和纳米粒子表面的PEG密度密切相关。纳米粒子表面PEG层的结构构象对纳米粒子在血清中的胶体稳定性和蛋白质吸附有显著影响,从而对纳米粒子在血液中的循环时间有根本性影响。因此,研究者TTB@PEG-3K的循环时间较长是由于PEG分子表面的构象,DTTB@PEG-3K能有效地抑制补体化合物在纳米粒子上的吸附,导致单核吞噬细胞系统(MPS)对纳米粒子的摄取减少,有助于延长血液循环时间。


广州医科大学郭伟圣教授课题组——光声与纳米药物在体内的实时药物评价

图2. 4T1荷瘤小鼠静脉注射后不同时间获得的具有代表性的体内光声图像(A)和DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K,和DTTB@PEG-5K在NIR-II荧光图像(C)


4T1肿瘤区不同时间光声(B)和NIR-II荧光(D)信号的半定量分析。E、 DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K,和DTTB@PEG-5K注射后36小时的体内分布。F、 实时记录裸鼠静脉注射后60分钟内的活体血管成像DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K,和DTTB@PEG-5K。G、 基于横截面剖面的Vesselwhm宽度分析(F中的红线)。H、 DTTB@PEG-1K,和DTTB@PEG-5K静脉注射后的药物动力学分析。拟合曲线为R2值分别为0.9756、0.9961和0.9882的单相衰减函数。循环半衰期(t1/2)分别为0.95、1.49和0.54小时(数据以平均值±标准差表示,n=3。统计学分析采用双尾不配对t检验)。


结论


综上所述,研究者利用NIR-II荧光纳米平台对聚乙二醇化纳米药物进行实时药剂学评价的方法。所设计的NIR-II发光体在808nm处具有较大的吸收系数,在NIR-II窗口具有较高的荧光量子产率。用NIR-II型发光体结合聚乙二醇化形成纳米药物并监测其再体内的代谢行为。体内NIR-II荧光和光声成像结果表明,适当的聚乙二醇化有助于延长在血液中停留的时间、提高肿瘤靶向性及良好的生物安全性,从而实现长循环NIR-II纳米药物的高效光热治疗。本研究提出了一个在体内对纳米药物进行实时药物评价的方法,并展示了NIR-II纳米平台在纳米药物开发中的潜力。

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